东富龙CES系统应用于VERO微球载体3D培养技术工艺

一、前言

        Vero 细胞是非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。Vero 细胞系是连续的非整倍体细胞，可以经过许多分裂周期而不衰老。

        与作为疫苗生产的原代细胞和二倍体细胞相比，Vero 细胞具有以下特点: 

        ■来源方便、生长速度快、易于培养，对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;

        ■遗传性状稳定，恶性转化程度低，可用于生物制品的生产; 

        ■可通过微载体和悬浮培养方式进行规模化培养。

        Vero 细胞在过去的二十多年已经获批用于生产许多人用病毒性疫苗，比如狂犬疫苗、流感疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。

二、VERO规模化培养技术

         将VERO细胞进行悬浮驯化后进行大规模培养的技术工艺，应用于生物药生产上产物表达受限，技术工艺还不成熟。因此在实际生产应用中，VERO用于生物药大规模生产过程的培养技术工艺一般采用微载体悬浮培养模式，该培养模式把单层培养和悬浮培养融合起来，具有两种方法的优点，与传统培养方式相比，表现出了巨大的优越性：

        ●微载体培养系统有最高的表面积/体积比，可以在较小的空间内提供足够的表面积供细胞贴附生长，单位体积培养细胞的产率大大高。和二维培养相比，不会受到表面积限制，从而使获得更高的细胞密度成为可能； 

      ●微载体经过化学修饰处理后对细胞没有毒性，拥有了更适宜细胞生长的大小和表面，而且具有一定的透明度，可以在显微镜下直接观察贴壁细胞的贴附，扩展和生长情况； 

      ●微载体悬浮于培养基中，为细胞提供了均一的生长环境，培养参数（如pH、气体压力、DO 等）易于在线监测和控制，生产过程的重复性更好； 

      ●细胞收获过程简单，减少了人力，物理和财力的浪费，劳动强度小，操作简便，所需人员少，大大降低污染，工艺容易放大生产。

三、VERO微球载体3D培养解决方案

●商业化培养基

       VERO SFM01培养基为无血清培养基，极低蛋白，不含血清及任何动物源成分及水解物。适用于VERO细胞无血清培养体系下的贴壁培养，可用于VERO细胞在2D(培养瓶，细胞工厂等)及3D微载体反应器下的规模化培养及产物表达生产，培养过程不需要添加血清。支持VERO快速高密度扩增及产物高效稳定表达。可用于狂犬疫苗等相关产品的研发和生产过程，可支持从研发至规模化生产整体过程。

       PDE RecTrypsin是一种丝氨酸蛋白酶，能选择水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基末端所构成的肽链，可降解细胞间结合蛋白。本品是通过基因重组技术获得的，无动物源组分。本品在重组毕赤酵母中表达，经分离纯化获得。本品为细胞培养级的重组胰蛋白酶，不含DFP、 PMSF 和 TLCK 等酶抑制剂，具有天然胰蛋白酶相同的活性和特异性。可应用于疫苗、干细胞、药物筛选、抗体等领域细胞消化过程。

●一次性生物反应器--CES-10L

●Image一次性细胞培养袋-- 2L CES-BAG

四、CES系统应用于VERO微球载体3D培养方法

1.种子细胞复苏培养：

冻存VERO细胞37℃水浴复苏，以40000cell/cm2的密度接种于T175培养瓶中培养，4-5天后，观察细胞已长至复层即可消化（300000-350000 cell/cm2）。

2.VREO传代放大培养： 

VERO细胞消化，按40000cell/cm2接种至10层细胞工厂进行放大培养，直至到达上生物反应器载体培养所需细胞量。

3.载体处理及上袋准备

3.1按3g/L准备上袋所需球状载体，每克载体用100mL的DPBS水化，硅化过的容器中进行，等待载体吸水膨胀沉降，可温和搅拌，至少3小时。

3.2.去掉上清，按每克载体50mL重新加入DPBS，温和搅拌后静置15min以上，去掉上清。重新加入DPBS，灭菌。

3.3.载体冷却至室温后泵入2L CES-BAG中，载体沉降后通过灌流膜排出上清。后使用培养基润洗一次，重新每克载体比例接入100mL培养基，将角度设为4，速度设为10，开启温度控制36.5℃，以100mL空气流量通入5%CO2平衡培养基（pH7.2-7.4）。

4.VERO上袋接种

4.1.根据载体表面积计算接种细胞量，按40000cell/cm2将细胞工厂消化的细胞悬液接入事先平衡好的放有3g/L微载体的2L CES-BAG，控制培养体积为1L。

4.2.以温度36.5℃，角度6°，转速16rpm，进行CES参数设定，运行5min，使载体与VERO细胞悬液充分接触，持续约5min；

4.3.以温度36.5℃，角度1°，转速1rpm进行CES参数设定，低角度转速运行2h，提供稳定的环境，促进细胞贴壁。

4.4.重复4.2~4.3作业步骤2~3次，取样显微观察细胞贴壁情况。

随着静置时间的延长，2h-4h-6h游离VERO细胞不断减少，逐渐贴上载体开始伸展。

5.VERO细胞扩增培养

5.1.开始培养（D0），以温度37℃，角度4°，转速6rpm进行CES参数设定并运行，每天取样进行观察并检测葡萄糖、乳酸等含量。

5.2.D2提高转速至8rpm，继续培养。

5.3.D3开启灌流，按1L/24h进行持续灌流培养。

6.VERO收获与计数

D5胰蛋白酶消化收集细胞，结晶紫染色计数（收获细胞可进行下一级放大培养）。

VERO微球载体培养观察

VERO微球载体培养扩增前后TNC对比

       从上图可知，VERO按3E5/mL接种至微球载体进行培养，在东富龙CES，CES-BAG及VERO无血清培养基组成的培养体系下，D4天细胞密度达到2.05E6/mL，细胞扩增6.83倍，平均倍增时间PDT为34.625h。

五、CES系统应用于VERO微球载体3D培养方法总结

        使用东富龙CES一次性细胞扩增系统，配套VERO细胞无血清培养基及一次性细胞培养袋组成的密闭式培养体系，可有效实现VERO细胞微载体3D规模化放大培养，可用于VERO规模化放大及产物表达生产，可为基于VERO细胞的生物药规模化生产提供有效的解决方案。

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